La teoría quimiosmótica enunciada por Peter Mitchell, explica cómo la energía derivada del transporte de electrones por la cadena de transporte de electrones se utiliza para producir ATP a partir de ADP y Pi. La bomba de protones: el transporte de electrones está acoplado al transporte de H+ a través de la membrana interna mitocondrial desde el espacio intermembranal. Este proceso crea simultáneamente a través de la membrana interna mitocondrial un gradiente eléctrico (con más cargas positivas en el exterior de la membrana que en la matriz mitocondrial) y un gradiente de pH (el exterior de la membrana está a un pH más ácido que el interior). La energía generada por este gradiente es suficiente para realizar la síntesis de ATP.
De acuerdo con la teoría quimiosmótica, los protones son bombeados hacia afuera de la matriz mitocondrial, a medida que los electrones descienden a lo largo de la cadena de transporte electrónico, que se encuentra en la membrana mitocondrial interna. El movimiento de protones a favor del gradiente electroquímico, a medida que pasan a través del complejo de la ATP sintetasa §, suministra la energía por medio de la cual se regenera el ATP a partir del ADP y el fosfato inorgánico. El número exacto de protones bombeados fuera de la matriz, a medida que cada par de electrones desciende a lo largo de esta cadena, aún debe ser determinado, al igual que el número que debe fluir a través de la ATP sintetasa § por cada molécula de ATP que se forma. Se estima que la membrana interna de una mitocondria, en la célula hepática, tiene mas de 10.000 copias de cadenas transportadoras de electrones y complejos ATP sintetasa.
ESTRUCTURA Y FUNCION DE LA CADENA RESPIRATORIA
El flujo de electrones en las reacciones de oxido-reducción es responsable, directa o indirectamente de todo el trabajo realizado en los organismos vivientes. En los organismos no fotosintéticos, las fuentes de electrones son compuestos reducidos (los alimentos); en los organismos fotosintéticos, el donador inicial de electrones es una especie química excitada por la absorción de la luz solar. El flujo de los electrones en el metabolismo es un proceso complejo, los electrones se mueven a partir de varios metabolitos intermedios a acarreadores de electrones especializados en las reacciones catalizadas por enzimas. Posteriormente, los acarreadores donan los electrones a aceptores con elevadas afinidades por los electrones, este último proceso, genera energía. Las células contienen una variedad de transductores de energía, los cuales convierten la energía del flujo de electrones en trabajo.
El transporte de electrones, es la fuente principal de energía para las actividades celulares, libera grandes cantidades de energía libre, la mayor parte de la cual se almacena en forma de ATP en la fosforilación oxidativa. Las enzimas que catalizan el este proceso, son generalmente más complejas tanto estructuralmente como en su mecanismo catalítico que las enzimas de las otras vías metabólicas, y por tanto son menos conocidas. La mayoría están en la membrana interna mitocondrial, por lo cual es complicada su extracción y purificación. Tampoco es bien conocido cómo la liberación de energía libre que se produce durante el transporte de electrones se conserva y transforma en la energía del enlace fosfato durante la fosforilación oxidativa y las síntesis del ATP. Por lo anterior, estas enzimas son un modelo de estudio muy atractivo.
Todos los siguientes procesos: el transporte de electrones, la energía libre de la transferencia de electrones del NADH y FADH2 al O2 vía centros redox unidos a proteínas, está acoplada a la síntesis de ATP.
FOSFORILACION OXIDATIVA Y SINTESIS DE ATP
La respiración § se desarrolla en dos etapas: el ciclo de Krebs y el transporte terminal de electrones . En el curso de la respiración, las moléculas de tres carbonos de ácido pirúvico producido por la glucólisis § son degradadas a grupos acetilo de dos carbonos, que luego entran al ciclo de Krebs. En una serie de reacciones en el ciclo de Krebs, el grupo acetilo de dos carbonos es oxidado completamente a dióxido de carbono. En el curso de la oxidación de cada grupo acetilo se reducen cuatro aceptores de electrones § (tres NAD+ y un FAD) y se forma otra molécula de ATP .
En el ciclo de Krebs. los carbonos donados por el grupo acetilo se oxidan a dióxido de carbono y los electrones pasan a los transportadores de electrones. Lo mismo que en la glucólisis, en cada paso interviene una enzima § específica. La coenzima A es el nexo entre la oxidación del ácido pirúvico y el ciclo de Krebs. A modo de resumen: en el ciclo de Krebs se producen una molécula de ATP, tres moléculas de NADH y una molécula de FADH2 que representan la producción de energía de este ciclo. Se necesitan dos vueltas del ciclo para completar la oxidación de una molécula de glucosa. Así, el rendimiento energético total del ciclo de Krebs para una molécula de glucosa es dos moléculas de ATP, seis moléculas de NADH y dos moléculas de FADH.
La etapa final de la respiración es el transporte terminal de electrones , que involucra a una cadena de transportadores de electrones y enzimas § embutidas en la membrana interna de la mitocondria . A lo largo de esta serie de ransportadores de electrones, los electrones de alta energía transportados por el NADH de la glucólisis y por el NADH y el FADH2 del ciclo de Krebs van "cuesta abajo" hasta el oxígeno. En tres puntos de su pasaje a lo largo de toda la cadena de transporte de electrones, se desprenden grandes cantidades de energía libre que impulsan el bombeo de protones § (iones H+) hacia el exterior de la matriz § mitocondrial. Esto crea un gradiente electroquímico a través de la membrana interna de la mitocondria. Cuando los protones pasan a través del complejo de ATP sintetasa §, a medida que vuelven a fluir a favor del gradiente electroquímico al interior de la matriz, la energía liberada se utiliza para formar moléculas de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. Este mecanismo, en virtud del cual se lleva a cabo la fosforilación oxidativa , se conoce como acoplamiento quimiosmótico.
INHIBIDORES Y DESACOPLANTES
Hay seis tipos de venenos que afectan la función mitocondrial:
1. Inhibidores de la cadena que bloquean la cadena respiratoria.
La rotenona, toxina de una planta, utilizada por indios amazónicos como veneno, también ha sido usada como insecticida.
Actúa a inhibiendo el complejo I. Inhibe la reoxidación del NADH, no afecta la del FADH2. Inhibe la oxidación del malato, que es dependiente del NAD+, no así la del succinato. El succinato entra en el segundo punto de entrada a la cadena, posterior al del NAD+.
El amital (barbitúrico) inhibe al complejo I, afecta las oxidaciones dependientes del NAD+.
La antimicina A (Antibiótico).
Actúa a inhibiendo el complejo III. Inhibe la reoxidación del NADH y del FADH2.
El cianuro bloquea el paso de electrones del citocromo a3 al oxígeno.
Estos inhibidores detienen el paso de electrones de modo que no hay bombeo de protones. Sin gradiente de protones, no hay síntesis de ATP.
2. Inhibidores de la fosforilación oxidativa, venenos que inhiben la ATP-sintasa.
La oligomicina, un antibiótico producido por Streptomyces, inhibe a la ATPasa al unirse a la subunidad Fo e interferir en el transporte de H+ a través de Fo, inhibe por lo tanto la síntesis de ATP.
Diciclohexilcarbodiimida (DCCD), un reactivo soluble en lípidos, también inhibe el transporte de protones por Fo al reaccionar con un residuo de glutámico en una de las subunidades de Fo de mamíferos.
En estas condiciones el gradiente de protones que se produce es mayor que lo normal, sin embargo la energía potencial de éste no puede ser utilizada para producir ATP.
3. Venenos que hacen permeable la membrana mitocondrial interna a los protones. Estos agentes eliminan la relación obligada entre la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa que se observa en mitocondria intacto.
Estos venenos, como el 2,4 dinitrofenol (DNP), el carbonilcianuro-p-trifluorometoxi-hidrazona (FCCP) y el carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona (CCCP) desacoplan la fosforilación oxidativa de la cadena respiratoria, se conocen como agentes desacopladores.
Son compuestos liposolubles y ácidos débiles. Las formas disociadas presentan carga negativa altamente deslocalizada, de modo que el campo eléctrico de los aniones es muy débil, ello permite que difundan libremente a través de un medio no polar como las membranas fosfolipídicas. Este comportamiento no es usual, la gran mayoría de iones con carga son excluidos de un ambiente no polar.
La forma protonada, sin carga eléctrica de estos compuestos, pasa a través de la membrana interna mitocondrial intacta, descargando así el gradiente de pH. En la matriz, a pH más bajo, el ácido débil se disocia, la forma disociada pasa la membrana interna, destruyendo el potencial de membrana. Este proceso se puede repetir, de modo que una pequeña cantidad del agente desacoplante puede catalizar el paso de una cantidad enorme de protones y hacer un corto circuito en la cadena respiratoria.
En resumen, permitiendo el paso de protones a través de la membrana, se disipa el gradiente de protones, no hay bombeo de protones a través de la ATP-sintasa con producción de ATP.
Los agentes desacoplantes son todos sintéticos, sin embargo en el mitocondria del tejido adiposo pardo una proteína desacopladora (termogenina) participa en el delicado control de la termogénesis.
4. Inhibidores de transporte (atractalósido) que previenen ya sea la salida del ATP o la entrada de material combustible a través de la membrana mitocondrial interna.
5. Ionósforos (valinomicina, nigericina) que permiten el paso a través de la membrana a compuestos que normalmente están impedidos.
6. Inhibidores del ciclo de Krebs (arsenito) que bloquean una o más enzimas del ciclo de Krebs.
MEDICION DEL CONSUMO DE OXÍGENO
Respirómetros a presión constante
El principio de funcionamiento de los respirómetros a presión constante se basa en la fijación en medio acuoso alcalino del CO2 liberado por los organismos, y la consecuente disminución del volumen gaseoso de la cámara donde aquel se encuentra, debido al consumo del O2. Estos respirómetros funcionan a presión constante, pues continuamente se nivela la presión interna con la presión externa, a través de un líquido cuyo desplazamiento sobre una pipeta graduada, de disposición horizontal, equivale al volumen de oxígeno consumido. El dispositivo se sumerge en un baño de agua a fin de mantener estable la temperatura.
Respirómetros a volúmen constante
Un método tradicionalmente utilizado para la medición de la tasa de consumo de oxígeno a volúmen constante es el método de Warburg, que basicamente consiste en un recipiente con la muestra biológica, unido a un manómetro Durante la medición, las conexiones externas del recipiente mencionado (reaction-vessel en la Figura) permanecen cerradas, registrándose el cambio de presión en el manómetro (por la diferencia en la altura del líquido manométrico en ambas ramas del manómetro). Una versión aún utilizada de este método esta dado por el sistema de respirómetros múltiples ideado por Gilson en el cuál la diferencia de presión producida durante la medición se mide sobre una perilla micrométrica luego de restituir la altura de la columna de líquido manométrico a su valor original. En todos los casos el CO2 es fijado en medio alcalino (hidróxido de sodio concentrado, o similar).
En primer lugar, se calcula el volumen de O2 presente en la cámara y medido por el electrodo, de acuerdo con el siguiente algoritmo:
µl O2= Lectura en ppm (mg/l) x Vol.O2 en 1 mg (ml/mg) x VC (l)
donde:
Vol. O2 en 1 mg (a 760 mmHg y 273 ºK)= 22,4 ml / 32 mg (1 mol) = 0,7 ml/mg
VC= volumen neto de la cámara de medición.
La tasa de consumo de oxígeno se calcula luego como la pendiente de la regresión de los µl O2 remanentes en cada respirómetro en función del tiempo De esta manera la tasa de consumo queda expresada, por ejemplo, en µl O2/min . Es necesario multiplicar luego la pendiente obtenida de la regresión µl O2 versus tiempo por –1.
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